一、微生物的概念與分類
在自然界里,有許多肉眼不能直接看見,必須借助于顯微鏡放大才能觀察到微小生物,這些微小生物總稱為微生物。
微生物的分類,目前公認的包括七大類。即病毒→立克次體→支原體→細菌→放線菌→螺旋體→真菌(酵母菌、霉菌)。排在前面的小而低等,排在后面的逐漸大而高等,本文內容只重點介紹三類。
二、微生物的特點
微生物除了個體微小、結構簡單這一基本特征以外,還有一些其他特點也是與眾多生物不同的。
(一)種類繁多
微生物的數量和種類是十分驚人的。一滴水,一顆土粒往往都是一個微生物“社會”。其中以土壤內的生存密度最大,1克較肥活的土壤常含有幾億到幾十億個微生物;貧瘠土壤每克也含有幾百萬到幾千萬個,一只骯臟的蒼蠅,全身能攜帶5億多個細菌。
三對足能粘附700萬至1000萬個細菌,可見微生物的密集度之大。微生物的各類也很可觀,自然界已知的微生物就有10萬種左右。
(二)分布廣泛
微生物是地球上分布最廣泛的一類生物。在遼闊的自然界中,無論土壤、水域、空氣以及動物、植物、人體內外都有大量微生物存在。有些微生物能夠在異常的條件下生存,例如耐酸菌能在10%的硫酸溶液中生活,嗜熱菌能在溫度高達98℃以上的溫泉中生活,有的甚至在高達200~300℃的深;鹕娇诟浇材芑顒,嗜鹽菌在含鹽量高達23%~25%的死海里,甚至30%的摘錄化鈉溶液中和鹽塊上存活,顯然這是一般生物所望塵莫及的。
(三)繁殖迅速
微生物的繁殖速度也是同樣驚人的,比高等動植物快得多,有些細菌,在適宜條件下每20分鐘就可以繁殖一次,例如大腸桿菌,1個細菌經20分鐘就分裂成2個,每小時可分裂3次,這樣,1個細菌繁殖3代就產生8個細菌。即:
1小時 =8個
2小時 8×23=64個
3小時 64×23=512個
4小時 512×23=4096個
24小時 1×272=4.7*1021
照此速度繁殖下去,24小時就可繁殖72代,數量大約為4.7*1021個。所以細菌培養24小時就可以看見菌群。其增殖速率是相當驚人的。但因種種條件(營養物質)限制,這種繁殖速度是不能持久的。盡管如此,微生物這種快速繁殖能力應用到工業發酵上,在短時間內得到大量增殖,收或較多的產物,也是有著重要意義的。
三、常見的微生物
(一)細菌
細菌是能夠獨立地進行生長繁殖的單細胞生物,種類很多,大小不一,平均約1.0μm,用顯微鏡放大1000倍,也只有1.0mm大小,所以肉眼看不見。
細菌的形態是不完全相同的,一般可歸納為三種類型:
1.球菌
單獨存在時呈球形,按其分裂的方式和分裂后的排列,可分為單球菌、雙球菌、鏈球菌、四聯球菌、八疊球菌、葡萄球菌等,菌體直徑約0.5~1.0μm。
2.桿菌
菌體呈桿狀或近似桿狀。大小、長短、粗細很不一致,有的粗短近似球菌,稱為球桿菌;有的桿菌一端膨大似棒狀,稱為棒狀桿菌;有的排列成鏈狀,稱為鏈桿菌;有的生長成側枝,稱為分枝桿菌。大部分桿菌長約2.0~3.0μm,寬0.5~1.0μm,病原細菌中桿菌的種類最多。
3.弧菌和螺菌
菌體呈彎曲或螺旋狀,只有一個彎曲,呈逗點狀為弧菌,如霍亂弧菌;有數個彎曲較為堅韌的為螺菌,如鼠咬熱螺菌。
(二)病毒
病毒是體積最小,結構最簡單,沒有細胞結構,而只能寄生在其它生物的細胞內,利用宿主細胞的酶系統和營養物質進行生長繁殖的原始生物。病毒的形態多數呈球形,少數呈桿狀或磚塊狀,細菌病毒(噬菌體)多數呈蝌蚪狀,平均大小只有0.1μm,比細菌約小10倍,最小的病毒只有0.01μm,接近蛋白質分子。病毒大多能通過濾菌器,故俗稱濾過性病毒。
(三)真菌
真菌是體積最大,結構比較復雜的微生物。真菌在自然界里廣泛存在,如使衣物、食品發霉的霉菌,釀酒或發醇面粉的醇母菌都是真菌。病原真菌也較常見,如皮膚淺表的癬菌。真菌對熱的抵抗力不強,60℃加熱1小時即被殺死。真菌分單細胞真菌和多細胞真菌;單細胞真菌和多細胞真菌;單細胞真菌通稱為酵母菌。多細胞真菌通稱為霉菌。
四、細菌細胞的特殊結構
有的細菌除具有上述基本結構外,尚有某些特殊結構,如莢膜、芽胞、鞭毛、菌毛等。
1.莢膜
有些細菌在一定的營養條件下,向細胞壁表面分泌一種粘液狀物質,形成一層較厚的膜(約0.2μm)稱為莢膜。莢膜中含有大量水分,莢膜對菌體有保護作用,可保護細菌抵抗干燥。細菌的莢膜與細菌的致病力有關,具有莢膜的細菌不易被白細胞所吞噬,故能在機體內生長繁殖,引起感染。
2.芽胞
某些細胞生長到一定時期或當外界條件改變時對細菌生長不利時,菌體內的細胞漿發生脫水濃縮,逐漸形成圓形或橢圓形的小體,位于菌體中央或末端,稱為芽胞,如下圖所示,芽胞是細菌的休眠體,一個繁殖體只能形成一個芽胞。芽胞外部有數層厚而致密的膜,可抵御外界不良的環境,對于高溫、干燥、光線、化學藥品等有抵抗力比繁殖體為強,沒有形成芽胞的細菌,在70℃以上就逐漸死亡,而芽胞卻能抵抗100℃或更高一些的溫度。因此,殺死芽胞要比殺死細菌的繁殖體困難得多,有的芽胞存活多年而不喪失其活力,當遇到合適條件又可生長繁殖,因此滅菌的效果應以殺死芽胞為標準。
五、細菌的生長繁殖和代謝產物
1.細菌的繁殖方式
細菌的繁殖方式是簡單無性二分裂法,即一個細菌分為二個,二個分為四個,如此繼續下去。球菌由于沿著一個平面或幾個平面,故呈鏈狀、葡萄狀、雙球菌、四聯球菌、八疊球菌等狀態;桿菌一般沿橫軸分裂。
大部分細菌的繁殖速度很快,如大腸桿菌在適宜的條件下,每20分鐘就可繁殖一代,若保持此速度繁殖10小時后,一個細菌可以繁殖10億個。細菌繁殖雖然如此迅速,但它是受各方面因素所制約,決不能無限制地繁殖下去。
2.生長繁殖的條件
1) 水
細菌的生長繁殖是從外界吸收營養物質,通過本身含有的許多酶系統,進行一系列的生化反應分解轉化成簡單物質,然后加以吸收利用。水是細菌生活所不可缺水的物質。
2)碳和氮化合物、無機鹽等
這些是細菌營養所必須的物質。
3)氣體
氧、二氧化碳和氮與細菌的生長繁殖有密切的關系。有些細菌必須有充分的氧氣供應才能生活,稱為需氧菌,如結核桿菌;另一類則恰相反,要在缺氧的環境下才能生活,有氧存在反而對它們生長不利,稱為厭氧菌,如破傷風桿菌;大多數但致病菌處于這兩者之間,有氧無氧都生活的則稱為兼性厭氧菌,如大腸桿菌。
(4)酸堿度
大多數病原菌生長最適宜的酸堿度為pH7.2~7.6。
(5)溫度
根據細菌對溫度要求的不同,可分為嗜冷菌、嗜溫菌及嗜熱菌。一般病原菌的適宜溫度基本與人類體溫相同,因而實驗室培養細菌均采用37℃。(霉菌25℃)
3.代謝產物
細菌在生長繁殖中,可產生大量的代謝產物,有的分泌到菌體外面,有的包含在菌內,有一些代謝產物對人體有益,如抗生素、維生素等;但有一些代謝產物對人體是有害的,如熱原等,這些產物一旦進入機體可以致病或使體溫升高。
六、外界環境中對微生物生長的影響因素
1.溫度和化學因素
溫度和化學因素對微生物的生長繁殖影響極大,將在物理滅菌法和化學滅菌法中講述。
2.pH值
pH值對微生物生長的影響 ,中性繁殖最快。
3.濕度
溫度可以促使細菌生長,特別對霉菌繁育更快。因此防止濕度過大對于避免染菌霉敗有一定的作用。
水的活度對細菌生長的重要性,提高食品成分結合水分能力從而改變水活度。
4.滲透壓
微生物的細胞具有半透膜的性質,可以透水,但對于其他物質的透過則有選擇性,低滲藥液可使細胞膜膨脹,但高透藥液可使細胞內水分滲出而處于脫水狀態。所以一般微生物在濃鹽溶液或濃糖溶液中不易生長繁殖,就是由于細菌細胞內水分滲出而脫水的緣故。如蔗糖是微生物的良好營養;單糖漿含蔗糖85%,為其等滲濃度9.25%的9倍多,卻能保持不長菌;若濃度不夠,容易長菌敗壞。
七、有關名詞解釋
滅菌 系指殺死或除去所有微生物的繁殖體和芽胞,使之完全無菌。
消毒 系指僅僅殺滅病原微生物,使之不成為傳染源。
殺菌 系指使用化學藥品或物理因素,對微生物在短時間內起殺滅的作用。
抑菌 即抑制微生物繁殖體的生長及其繁殖。
防腐 系指防止或抑制微生物生長繁殖的方法。
無菌 系指沒有任何活的微生物存在。
八、物理滅菌法
(一)加熱滅菌法
加熱可破壞微生物中酶、蛋白質和核酸,導致微生物死亡。加熱滅菌又分干熱滅菌法和濕熱滅菌法。在同一溫度下,濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好。主要是因濕熱滅菌時,有水分存在,蛋白質容易變性。水分又易使微生物膜壁潤濕,濕熱的穿透力比干熱大。
干熱滅菌法 常用的有火焰滅菌法與干熱空氣滅菌法兩種。
(二)紫外線滅菌法
是指用紫外線照射殺滅微生物的方法。一般用于滅菌的紫外線波長是200~300nm,滅菌力最強的波長是253.7nm。紫外線作用于核酸蛋白促使其變性,同時空氣受紫外線照射后產生微量臭氧,從而起共同殺菌作用。紫外線進行直線傳播,可被不同的表面反射,穿透力微弱,但較易穿透清潔空氣及純凈的水。因此本法適用于照射物體表面之滅菌、無菌室的空氣及水的滅菌;不適用于藥液的滅菌、固體物質深部的滅菌;普通玻璃可吸收紫外線,因此裝于玻璃容器中的藥物不能用此法滅菌。紫外線對人體照射過久,會發生結膜炎,紅斑及皮膚燒灼等現象,故一般在人入室前開啟紫外線燈1~2小時,關閉后人才進入潔凈室。如果必須在人進去后仍要開紫外線滅菌,則人的皮膚及眼睛應有有效的防護措施。一般在6~15m3的空間可裝置30瓦紫外線燈一盞,離地面2.5~3m為宜。
用紫外線照射滅菌時要注意下列問題:
1、紫外線的殺菌力,隨使用時間增加而減退,一般使用時間達到額定時間70%時應更換紫外線燈管,以保證殺菌效果。國產紫外線燈平均壽命一般為2000h。
2、紫外線的殺菌作用隨菌種不同而不同,殺霉菌的照射量要比殺桿菌大40~50倍。
3、紫外線照射通常按相對濕度為60%的基礎設計,室內濕度增加時,照射量應相應增加。
4、紫外線滅菌效果與照射的時間長短有關,這需要通過驗證來確定照射時間。
5、紫外照射燈的安裝形式及高度,應根據實際情況,參考使用說明決定。
滅菌方法的驗證采用生物指示劑挑戰試驗,生物指示劑多用枯草芽孢桿菌。
(三)微波滅菌法
微波是指頻率在30~3000MHz之間的電磁波。水可強烈地吸收微波,使其極性分子轉動,分子間的磨擦而生熱,且升溫迅速,靠熱力而滅菌。在數十秒至幾分鐘之內可達100~150℃,并全部殺死液體中的微生物,適于水溶性注射液的滅菌。另外,固體藥材飲片及固體制劑(丸劑、散劑、膠囊粉等)也含少量水分,微波能穿透到固體內部,由表至里被均勻加熱,而起干燥、滅菌的作用。多用于口服液體制劑的滅菌,有望用于注射液的滅菌。但可能對某些藥品的PH值、含量、顏色有影響。
(四)輻射滅菌法
輻射滅菌是應用γ射線、β射線殺滅細菌的方法,又稱電離輻射,前者由鈷-60或銫-137發出,穿透力強;后者由電子加速器產生,帶電荷,穿透力弱,滅菌效果差。
九、化學滅菌法
化學滅菌法系指用化學藥品來殺滅微生物的方法。同一種化學藥品的低濃度時呈現抑菌作用,而在高濃度時則能起殺菌作用。其殺菌機理可能是:能使微生物蛋白質變性死亡,或與酶系統結合影響代謝,或改變膜壁通透性使微生物死亡等。常用的方法有消毒劑消毒法和化學氣體滅菌法等。
(一)消毒劑消毒法
消毒是指殺死病原微生物的方法。但化學消毒劑大多僅能殺死微生物的繁殖體而不能殺死芽孢,能控制一定范圍的無菌狀態。可將消毒劑配成適宜濃度,采用噴淋、涂擦或浸泡等方法對物料、環境、器具等進行消毒。常用的化學消毒劑有0.1%~0.2%苯扎溴銨溶液、3%~5%的酚或煤酚皂溶液、75%乙醇等。常用于物體表面滅菌。但要注意其濃度不要過高,以防止化學腐蝕作用。潔凈室的墻面、天花板、門窗、機器設備、儀器、操作臺、車、桌、椅等表面以及人體雙手(手套)在環境驗證及日常生產時,應定期清潔并用消毒劑噴灑,無菌室用的消毒劑必須在層流工作臺中,用0.22μm的濾膜過濾后方能使用。
(二)化學氣體滅菌法
系指利用化學藥品的氣體或產生的蒸汽進行殺滅微生物的方法。
1.環氧乙烷滅菌法
環氧乙烷滅菌法是利用環氧乙烷氣體進行殺菌的方法。它是一種傳統的滅菌方法,可應用于工衣滅菌、不耐加熱滅菌的藥品、醫用器具、設施、設備等的滅菌。
環氧乙烷滅菌系統,主要有下列四項互相制約的重要因素影響滅菌效果:
1、溫度;2、濕度;3、氣體濃度;4、滅菌時間。
因為環氧乙烷是易燃易爆物質,明火可以引起燃燒,同時由于氣體分解還可能引起爆炸,環氧乙烷滅菌中應十分注意安全問題。
2.甲醛等蒸汽熏蒸法
采用甲醛、丙二醇或過氧醋酸等化學品,通過加熱產生蒸汽進行空氣環境滅菌。
(1)計算房間體積,按10g/m3的比例稱出甲醛。
(2)將甲醛倒入甲醛發生器或加熱盤或燒杯中,并放好加濕用水,必要時還需加入高錳酸鉀(2~3g/m3),然后加熱(甲醛發生器用蒸汽加熱,加熱盤或燒杯用熱水盛入其中加熱)使其蒸發成氣體。
(3)滅菌流程:空調器停止運轉→啟動甲醛氣體發生器或在加熱盤中加熱甲醛 →讓甲醛氣體擴散約30分鐘→啟動空調器讓甲醛氣體循環約30分鐘→停止空調器,房間熏蒸消毒,時間不少于8小時→ 房間排氣,用新鮮空氣置換約2小時→ 恢復正常運行。
當相對濕度在65%以上,溫度在24~40℃時,甲醛氣體的消毒效果最好。
3、臭氧消毒法
臭氧(O3)的消毒原理是:臭氧在常溫、常壓下分子結構不穩定,很快自行分解成氧(O2)和單個氧原子(O),后者具有很強的活性,對細菌有極強的氧化作用,臭氧氧化分解了細菌內部氧化葡萄糖所必須的酶,從而破壞其細胞膜,將其殺死。多余的氧原子則會自行重新結合成為普遍氧分子(O2),不存在任何有害殘留物,故稱為無污染消毒劑。它不但對種種細菌(包括肝炎病毒、大腸桿菌、綠膿桿菌及雜菌等)有極強的殺滅能力,而且對霉菌也很有效。