當前所在頁面：一、乳及乳制品中真蛋白的概述
通過測定總氮含量而計算得到的蛋白質含量稱為粗蛋白(crude protein, CP) ,目前國家標準方法中測定的即為粗蛋白含量。乳中的氮含量包括蛋白態氮(proteinnitrogen,PN)和非蛋白態氮(non protein nitrogen,NPN) ,其中前者占95% ,后者約占5%。蛋白質是乳中的主要含氮物質,含量約2.8%～3.8%。乳蛋白包括酪蛋白、乳清蛋白及少量脂肪球膜蛋白。乳清蛋白中有對熱不穩定的乳白蛋白和乳球蛋白,上述蛋白構成了乳中的“真蛋白”。
蛋白質是牛奶的主要成分，且牛奶中的蛋白質是完全的蛋白質，由于含有人體必需的氨基酸，所以營養價值很高，牛奶中的蛋白質消化率可以達到90%～100%。乳中其他含氮物主要來源于乳中的氨、尿素、肌酸、肌酸酐、尿酸、乳清酸、多肽、馬尿酸、氨基酸和其他成分,這些成分構成了非蛋白質氮。
真蛋白(true protein,TP)即真正的蛋白質,在測定方面可定義為除了非蛋白質氮以外的蛋白態氮所計算得到的蛋白,正常情況下,天然乳中真蛋白的含量少于粗蛋白。酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白質,主要以膠束狀態存在于乳中,它是以含磷蛋白質為主體的幾種蛋白質的復合體,主要分為αs12酪蛋白、αs22酪蛋白、β2酪蛋白和κ2酪蛋白4種。一般情況下,乳品真蛋白中約有80%為酪蛋白,但其含量因個體差異、牧場管理、乳牛品種的不同而變化。
二、乳品中真蛋白測定的研究背景
牛奶及乳制品中含有豐富的蛋白質，但在牛奶收購、生產環節中，質量摻假事件時有發生，尤以“劣質假奶粉”事件和“三聚氰胺奶粉”事件為甚。目前，乳制品的消費量很大，根據FAO統計，世界人均年消費乳制品46kg，是日常飲食結構的重要組成部分，它的安全性直接影響到人們的身體健康，所以一旦出現質量或安全問題，它暴露的受害人群和風險就會高一些。尤其牛奶對嬰幼兒有代母乳的作用，在嬰兒成長的特定階段，成為其全部營養來源，因而，乳制品的安全至關重要，世界各國都對乳制品的質量控制制定了相當嚴密的標準體系。
目前檢測蛋白質的國家標準方法是凱氏定氮法，其結果只是氮的質量分數，而不是真正意義上的蛋白質質量分數。這種缺陷造成某些不法分子對牛奶進行摻假，添加硫酸銨、三聚氰胺、水解植物或動物蛋白等含氮物質。要杜絕這類問題，必須建立真蛋白質的檢測方法。
三、乳品中真蛋白的測定方法
1、電位滴定法
基本原理為：蛋白質的兩端有游離的具有酸性的羧基（－COOH）和堿性的氨基（－NH2），當加入甲醛溶液時，氨基上的兩個氫原子被次甲基所取代，于是便失去了氨基的堿性特性，從而使其呈酸性的羧基釋放出來，使溶液的電化學特性發生變化。再用氫氧化鈉標準溶液滴定游離的羧基（－COOH），從而用經驗公式計算其蛋白質含量。
與凱式定氮法相比，該法可以排除三聚氰胺、尿素對牛乳中蛋白質測定的干擾，其次該方法所需檢測儀器及試劑常規，操作簡便，而且大大縮短了測定時間，提高了工作效率，具有一定的推廣使用價值。但從其原理中不難得出此法不能排除銨態氮（氯化銨、硫酸銨、碳酸銨等）的干擾，有一定的局限性。針對這一漏洞唐英偉等人在2009年提出了改進方法即：在測定前在試樣中加入濃堿液加熱檢查有無氨氣放出，驗證有無銨態氮。若有，則先將銨態氮分離出去，再用電位滴定法測定；若沒有，則可直接用電位滴定法測定。
2、三氯乙酸-雙縮脲比色法該方法的基本原理為：采用150g/L的三氯乙酸溶液(在混合物中的最終濃度約為120g/L )沉淀乳中的蛋白質,用過濾法分離沉淀和溶液,沉淀部分含蛋白態氮,非沉淀部分(溶液)含非蛋白態氮。將濾渣收集起來,再用雙縮脲法進行定氮。即可得出樣品中的真蛋白含量。三氯乙酸-雙縮脲比色法可以較好地檢測出乳中的真蛋白。
該方法是對凱式定氮法的改進，在樣品檢測前先將其中的蛋白質沉淀，可以很好的排除三聚氰胺、尿素等非蛋白氮的干擾。后期采用雙縮脲法對濾渣進行蛋白質含量測定，且操作簡便迅速，可提高工作效率，但靈敏度比較低,測定范圍為1～20mg蛋白質,適用于精度要求不高的蛋白質含量測定。
3、紫外分光光度法紫外分光光度法的基本原理為：蛋白質中含帶共軛雙鍵的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基,使蛋白質具有吸收紫外光的性質,其吸收峰在280 nm 處,吸光度與蛋白質含量成線性關系,因此,通過測蛋白質溶液的吸光度,即可測得樣品中蛋白質的含量。該方法測得蛋白質量濃度的回收率在94.0%～106.7%之間，通過精密度實驗，得到相對標準偏差為2.06%。結果表明，紫外分光光度法檢測真蛋白質量濃度與其他3種檢測方法差異不顯著；且檢測結果不受人為添加非蛋白類含氮物質的影響。
紫外分光光度法檢測生鮮牛乳真蛋白質量濃度，方法快速、可行，非蛋白態氮不能計入蛋白質質量濃度，可以有效防止不法分子以含氮有機物冒充蛋白質的違法行徑。
4、考馬斯亮藍G-250法考馬斯亮藍法是由考馬斯亮藍G-250染料與蛋白質通過范德華引力結合,使蛋白質染色,通過比色測定蛋白質含量的方法。該方法精密度高,RSD為1.70%, 結果準確, 相對誤差較小, 回收率98.2%～100.3%。
考馬斯亮藍G-250 與蛋白質結合的反應十分迅速且穩定,這一方法具有靈敏度高、干擾物質少、測定快速、簡便等優點,不受酚類、游離氨基酸和緩沖劑、絡合劑的影響,適合大量樣品的測定，可推廣到其他乳制品及保健食品、植物蛋白飲料等中的蛋白質測定。但由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用于不同蛋白質測定時有較大的偏差。
5、凝膠柱層析——考馬斯亮藍染色法考馬斯亮藍染色測定蛋白質是一種經典的方法，但按傳統方法配成的顯色劑卻存在著溶解不完全、比色池上極易沉積等問題，實際操作時對測定的準確性干擾較大。為此2010年張弘等人對考馬斯亮藍顯色劑中進行了改良，加入了大分子的醇類和酚類物質，新研制的顯色劑溶液溶解度好，比色池上沉積很少，且穩定，存放一年不影響測定。此外還研發出了牛奶蛋白質快速檢測儀，該儀器體積小、操作簡便、檢測速度快、靈敏度高，且能有效消除添加的三聚氰胺、尿素、硫酸銨等無機氮，及水解植物和動物蛋白等小分子多肽氮對牛奶中蛋白質檢測的干擾，從而能從根本上杜絕牛奶中摻假蛋白檢測題，可用于現場牛奶真蛋白質快速檢測。結果表明，牛奶中蛋白質分子量絕大部分集中分布在1×104～7×104u以上和1×104u以下分子量的蛋白質所占的比例很小。綜合應用牛奶中蛋白質的分子量分布特征和考馬斯亮藍染色法的特性研發出。
該法通過對考馬斯亮藍進行改良，基于馬斯亮藍染色法的特性和牛奶中蛋白質分子量的分布特征研制出牛奶蛋白質快速檢測儀。分子量約1 ku以上含氮物中的肽鏈和考馬斯亮藍結合，在波長595nm處達到最大吸收值。牛奶中的蛋白質主要是酪蛋白和清蛋白兩大類，它們的分子量大多在1×104～3×104u；蛋白質分離檢測儀檢測的結果表明：牛奶中的蛋白質分子量集中分布在1×104～7×104u，和考馬斯亮藍的顯色作用非常明顯，因此靈敏度很高。牛奶中的其他物質，如脂肪、多糖、維生素等均不與考馬斯亮藍作用，摻假物質，如三聚氰胺、尿素和硫酸銨等基本也不顯色，因此能有效識別；而水解植物和動物蛋白中，大部分是小分子肽，只有很少一部分的大分子蛋白質才能顯色，但如果要達到和牛奶相同的顯色值，含氮量要達到牛奶的20倍左右才能做到，因此，用牛奶蛋白質快速檢測儀測定蛋白質，可有效地防止牛奶中摻假蛋白質的干擾，從而能從根本上杜絕牛奶中摻假蛋白的檢測問題，可用于現場牛奶真蛋白質的快速檢測。
6、毛細管電泳法電泳是指在電場作用下,帶電粒子向著與其所帶電荷電性相反的電極移動的現象。電泳法,就是指帶電荷的供試品(如蛋白質、核苷酸等) 在惰性支持介質(如濾紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等) 中,在電場的作用下,向其對應的電極方向按各自的速度進行泳動,由于各組分之間的移動速度不同,使各組分分離成狹窄的區帶,并用適宜的檢測方法記錄其電泳區帶圖譜或計算其百分含量的方法。
毛細管電泳法也稱高效毛細管電泳法,它是近十幾年發展起來的一項新的分析方法,結合了電泳和色譜兩大技術。
Miralles等人用CE法對乳中變性的β2乳球蛋白和對位2κ2酪蛋白進行了分離和定量測定,并研究了pH值、尿素濃度、檸檬酸濃度、電壓等因素對試驗結果的影響,結果表明該法可在30 min完成乳制品中變性β2乳球蛋白和對位2κ2酪蛋白的定量檢測。但是由于該法使用的儀器昂貴、操作較為復雜,在一定程度上限制了它的應用范圍。
7、紅外光譜分析法近紅外光譜是介于可見光(VIS)和中紅外光(MIR 或IR)之間的電磁波, 美國材料檢測協會(ASTM)將近紅外光譜區定義為波長780～2526nm的光譜區。通過分子振動、轉動的狀態變化在不同能級間產生躍遷,當其能量與近紅外光譜區內某一波長處光子的能量相當時,可產生近紅外光譜吸收。食品中蛋白質和多肽在這個波段的特征吸收可以用來測定蛋白質的含量。
近紅外光譜技術的主要特點有:分析速度快、分析效率高、適用的樣品范圍廣,對樣品無損傷等。已廣泛應用于谷物、乳類、肉類、烘焙類、豆類蛋白質的分析測定中,但儀器價格昂貴,靈敏度相對較低。
8、數字圖像法該方法是基于雙縮脲反應原理, 通過一次性采集標樣和試樣乳粉處理液的圖像信息,得出試樣乳粉的蛋白質含量。
王旭等人利用凱氏定氮法和數字圖像法測定添加了不同NPN的乳粉蛋白質含量, 分析非蛋白態氮對凱氏定氮法和數字圖像法測定乳粉蛋白質含量的影響。結果表明，對于沒有人為添加非蛋白態氮的乳粉來說, 用凱氏定氮法和數字圖像法測定結果具有較好的一致性。當乳粉中含有大量NPN時, 凱氏定氮法測得的粗蛋白含量無法體現蛋白質的真實情況。一旦乳粉中惡意添加大量非蛋白態氮,采用數字圖像法測定蛋白質含量, 其結果不受干擾。數字圖像法大體上可以看作針對真蛋白質特有的反應, 非蛋白態含氮物質對測定結果沒有影響, 測定乳粉中的真蛋白含量具有較高的準確性。
9、直讀法蛋白質分子凝聚從溶液中析出的現象稱為蛋白質沉淀(spancipitation),變性蛋白質一般易于沉淀,但也可不變性而使蛋白質沉淀。引起蛋白質沉淀的主要方法有鹽析、重金屬鹽沉淀、生物堿試劑以及某些酸類沉淀、有機溶劑沉淀、加熱凝固等。吳敏等人通過對生鮮牛乳進行脫脂和水浴加熱后,加入蛋白質沉淀劑、離心分離得到蛋白質沉淀,直接根據沉淀體積讀取出牛乳中蛋白質含量。結果表明，在置信度大于90%時,置信區間為(8.72±0.43),RSD為4.75%,此方法作為一種快速測量牛乳中蛋白質的方法,可廣泛用于各個奶站和奶廠收奶,也可用于質檢部門進行快速檢測,結果快速,比較準確,費時較短且成本低廉,不失為一種優良的快速檢測方法。
10、Udy染料染色法Udy染料染色法采用蛋白與一定pH的橙酸12染料結合的原理測定乳中的氨基酸,如精氮酸、組氨酸和賴氨酸,其中蛋白質的多肽長度須在5個氨基酸以上。其紅色的色澤隨蛋白的含量增加,即結合的越多而減退,即色澤的強弱與蛋白的濃度呈反比,因此只要在一定的波長下測定其色澤的程度,即可計算得到真蛋白的濃度。用Udy染色法測定牛奶樣品中的真蛋白含量只需不到1 min的時間,1967年,該法得到AOAC認可。
四、結論
由于中國國家標準中乳品蛋白質檢測方法的缺陷,出現摻加尿素、銨肥甚至三聚氰胺等氮含量高的有機物來提高“蛋白質含量”的違法操作,嚴重制約了我國乳制品的質量提升,影響了消費者的身體健康。近幾年來，關于乳品中真蛋白的檢測方法的研究也比較多，其中不乏有許多操作簡便、對設備要求不高、檢測時間短，靈敏度較高的方法，如直讀法、數字圖像法、紫外分光光度法、三氯乙酸——雙縮脲法等。這些方法的研究對規范我國乳品中關于真蛋白的檢測具有推動作用，為進一步提升乳品質量做出了貢獻。
