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【硬核分享】生物藥物常用檢測技術你知道多少?
發布時間:2020-11-05編輯:
生物藥近年來備受關注,藥品監管部門對生物藥的質量監管也越來越嚴格。提升實驗室生物藥分析檢測人員的專業技能迫在眉睫。本文匯總了一下主要介紹生物監測一些常用的方法,希望能對你有所幫助。


生物藥物檢測技術是指利用生物體(整體組織 ,離體組織微生物和細胞等)來測定藥物的生物活性的一種方法。它以藥物的藥理為基礎,以生物統計為工具,運用特定的實驗設計,在一定條件下比較供試品和相當的標準品或對照品所產生的特定反應,通過等反應劑量間比例的運算,從而測得供試品的效價。



一、一般雜質檢查


1、氯化物檢查法 

    

氯化物檢查法是利用氯化物在硝酸酸性溶液中與硝酸銀試液作用,生成氯化銀的白色渾濁液,與一定量標準氯化鈉溶液在相同條件下生成的氯化銀渾濁液比較,以判斷供試品中的氯化物是否超過了限量。


除另有規定外,取各藥品項下規定量的供試品,加水溶解使成25ml(溶液如顯堿性,可滴加硝酸使成中性),再加稀硝酸10ml;溶液如不澄清,應濾過;置50ml納氏比色管中,加水使成約40ml,搖勻,即得供試溶液。另取各藥品項下規定量的標準氯化鈉溶液,置50ml納氏比色管中,加稀硝酸10ml,加水使成40ml,搖勻,即得對照溶液。于供試溶液與對照溶液中,分別加入硝酸銀試液1.0ml,用水稀釋至50ml,搖勻,在暗處放置5min,同置黑色背景上,從比色管上方向下觀察,比較,即得。


以上檢查方法中使用的標準氯化鈉溶液每1ml相當于10μg的Cl。在測定條件下,氯化物濃度以50ml中含50~80μg的Cl為宜,相當于標準氯化鈉溶液5~8ml。在此范圍內氯化物所顯渾濁梯度明顯,便于比較。


2、硫酸鹽檢查法  

  

微量的硫酸鹽雜質,也是一種信號雜質。藥物中微量的硫酸鹽在稀鹽酸酸性條件下與氯化鋇反應,生成硫酸鋇微粒顯白色渾濁,與一定量標準硫酸鉀溶液在相同條件下產生的硫酸鋇渾濁程度比較,判定供試品硫酸鹽是否符合限量規定。   


檢查方法:取供試品,加水溶解成約40ml,置50ml納氏比色管稀鹽酸2ml,搖勻即得供試溶液;另取標準硫酸鉀溶液,置50ml納氏比色管中,加水使成約40ml,加稀鹽酸2ml,搖勻即得對照溶液;于供試溶液與對照溶液中分別加入25%氯化鋇溶液5ml,用水稀釋成50ml,搖勻,放置10分鐘,濁。鹽酸可防止碳酸鋇或磷酸鋇等沉淀生成,影響渾濁。但酸度過大可使硫酸鋇溶解,降低檢查靈敏度。50ml試中含2ml稀鹽酸為宜。


3、鐵鹽檢查法 

   

原理為鐵鹽在鹽酸酸性溶液中與硫氰酸銨生成紅包可溶性硫氰酸鐵配位離子,與一定量標準鐵溶液用同法處理后所顯的顏色進行比較。  


取各藥品項下規定量的供試品,加水溶解,使成25ml,移至50ml納氏比色管中,加稀鹽酸4ml與過硫酸銨50mg,加水稀釋成35ml后,加30%硫氰酸銨溶液3ml,再加水適量使成50ml,與標準鐵溶液一定量按相同方法制成的對照溶液比較,來判斷樣品中鐵鹽的量是否超過限量。

  

重金屬系指在實驗條件下能與硫代乙酰胺或硫代鈉作用顯色的金屬雜質。生產中遇到鉛的機會較多,且鉛又易在體內積蓄中毒,所以檢查時以鉛為代表。重金屬影響藥物的穩定性及安全性。一般采用以下四種方法:


(1)Pb2++H2S→PbS↓+2H+(硫代乙酰胺法):適用于溶于水、稀酸和乙醇的藥物,為最常用的方法。原理:硫代乙酰胺在弱酸性條件下水解,產生硫化氫,與重金屬離子生成黃色到棕黑色的硫化物混懸液,與一定量標準鉛溶液經同法處理后所呈顏色比較。適宜比色的范圍為10~20μgPb/35ml,pH值對呈色影響較大。 醫學教.育網搜集整理。  


(2)有機破壞后檢查法:適用于含芳環、雜環以及不溶于水、稀酸及乙醇的有機藥物。重金屬可與芳環、雜環形成較牢固的價健,可先熾灼破壞,使重金屬游離,再按第一法檢查。采用硫酸為有機破壞劑,溫度在500~600℃使完全灰化。所得殘渣加硝酸進一步破壞,蒸干。加鹽酸轉化為易溶于水的氯化物,與對照試驗比較。  


(3)硫化鈉法:適用于溶于堿而不溶于稀酸或在稀酸中即生成沉淀的藥物。以硫化鈉為顯色劑,Pb2+與S2-作用生成PbS微;鞈乙,與一定量標準鉛溶液經同法處理后所呈顏色比較。硫化鈉對玻璃有一定腐蝕性,應臨用新制。   


(4)微孔濾膜法:適用于含2~5μg重金屬雜質及有色供試液的檢查。重金屬限量低時,用納氏比色管難以觀察,用微孔濾膜濾過,重金屬硫化物沉集于濾膜形成色斑,與標準鉛斑比較,可提高檢查靈敏度。


5、砷鹽檢查法   


砷鹽是有毒的物質,多由藥物生產過程所使用的無機試劑引入。砷鹽和重金屬一樣,在多種藥物中要求檢查。中國藥典采用古蔡法和二乙基二硫代氨基甲酸銀(簡稱Ag-DDC法)法檢查藥物中微量的砷鹽。  


6、酸堿度檢查法 

     

檢查藥物中的酸堿性雜質。純凈原料藥水溶液的pH值應是較為恒定的,但在工藝中經酸或堿處理的藥物,如果控制不當,就會在產品中引入酸堿性雜質。酸堿性雜質的存在,可能影響藥物的療效或穩定性,因此,對在工藝中使用過酸或堿處理的藥物,或對酸堿不穩定的藥物,如酪類、酰胺類等,一般需進行酸堿度的檢查。酸堿度檢查所用的水應是新沸并放冷至室溫的水。酸堿度檢查的方法有以下幾種:


(1)酸堿滴定法


酸堿滴定法是在一定指示劑的條件下,用酸或堿的滴定液(如鹽酸滴定液或氫氧化鈉滴定液)滴定樣品中的堿性或酸性雜質,用消耗滴定液的體積來控制酸堿性雜質量。  


如氯化鈉酸堿度檢查的方法為:取本品0.50g,加水50ml溶解后,加溴麝香草酚藍指示劑(pH6.0~7.6,黃色~藍色)2滴,如顯黃色,加氫氧化鈉滴定液(0.02mol/L)0.10ml,應變為藍色;如顯藍色或綠色,加鹽酸滴定液(0.02mol/L)0.20ml,應變為黃色。


(2)pH值法


pH值法是通過測定一定濃度供試品溶液的pH值來控制藥物中酸堿性雜質量的方法。常用于制備注射劑原料藥中酸堿性雜質的控制。 

 

如青霉素鈉酸堿度的檢查方法為:取本品,加水制成每1ml中含30mg的溶液,依法測定,pH值應為5.0~7.0。


(3)指示劑法


指示法是利用酸堿指示劑在不同pH條件下顏色的改變來檢查酸堿性雜質的方法。如蒸餾水的酸堿度檢查方法為:取供試品10ml,加甲基紅指示液2滴,不得顯紅色(pH值在4.4以上):另取10ml,加溴麝香草酚藍指示液5滴,不得顯藍色(pH值在7.6以下)。


7、溶液顏色檢查法 

  

控制藥品有色雜質限量的方法,是對通常利用紫外檢測器進行有關物質高效液相色譜法測定的有效補充。有效雜質的來源一是由生產工藝中引入,二在貯存過程中由于藥品不穩定降解產生。一般有三種檢測方法:目視法、紫外可見分光光度法和色差計法。 


目視法:即將供試品溶液與各色調標準比色液進行比較,以判斷結果。  


紫外可見光光分度法:需要使用儀器紫外—可見分光光度計。   


色差計法:本法是通過色差計直接測定藥品溶液的透射出刺激值,求其顏色進行定量表述和分析的方法。當供試品溶液的顏色處于合格邊緣,目視法難以準確判斷時,以及供試品與標準比色液色調不一致時,更可顯示本法的優越性。判定方法是直接將標準比色液和供試品溶液的三刺激值(或色品坐標值)進行比較,或通過標準比色液和供試品溶液分別與水的色差值進行比較。 


8、易炭化物檢查法 

      

易炭化物系指藥品中夾雜的遇硫酸易炭化或易氧化而呈色的有機雜質。于比色管中將一定量供試品分次緩緩加入5ml硫酸中,振搖溶解后,靜置15分鐘,溶液呈現的顏色與規定的對照液比較,不得更深。


9、熾灼殘渣檢查法   

  

檢查不含金屬的有機藥物或揮發性無機藥物中混入非揮發性的無機雜質(金屬氧化物或無機鹽類),熾灼殘渣是經熾灼至完全灰化所殘留的物質。



10、干燥失重檢查法

    

取供試品,混合均勻(如為較大的結晶,應先迅速搗碎使成2mm以下的小粒)。分取約1g或各藥品項下所規定的重量,置與供試品同樣條件下干燥至恒重的扁形稱瓶中,精密稱定,除另有規定外,照各藥品項下規定的條件干燥至恒重。從減失的重量和取樣量計算供試品的干燥失重。


11、水分測定法   

   

共有4種方法,分別為烘干法、甲苯法、減壓干燥法和氣相色譜法。      

  

烘干法:測定供試品在規定的條件下經干燥后所減失水分的重量,主要指水分,也包括其他揮發性物質。根據減失的重量和取樣量計算供試品的含水量C%。本法適用于不含或少含揮發性成分的品種。  

     

甲苯法:測定供試品在甲苯加熱回流條件下,被蒸餾出的水量,根據水量和取樣量計算供試品的含水量。本法適用于含有揮發性成分的藥品。 

   

減壓干燥法:測定供試品在規定的壓力條件下干燥后所減失水分的重量,根據減失的重量和取樣量計算供試品的含水量。本法適用于含有揮發性成分的貴重藥品。 


氣相色譜法:以純化水為對照,無水乙醇為溶劑,適用熱導檢測器,測定貴重藥材及其制劑中的含水量。


12、可見異物檢查法    


可見異物是指存在于注射劑、滴眼劑中,在規定條件下目視可以觀測到的不溶性物質,其粒徑或長度通常大于50μm。


可見異物檢查法有燈檢法和光散射法。一般常用燈檢法,也可采用光散射法。


二、特殊雜質檢查法


1、宿主細胞(或菌體)蛋白殘留量的檢查法

2、外源性脫氧核糖核酸殘留量的檢查法

3、鼠免疫球蛋白G殘留量的檢查法

4、產品相關雜質的檢查法

5、殘余抗生素的檢查法


總體來說,由于藥物品種不同,所含的特殊雜質不同(與不同藥物的生產、貯存有關)。檢查方法也不同,一般按藥物和雜質在物理、化學性質上的差異,采用物理、化學方法檢查。


1、利用藥物和雜質在物理性質上的差異


臭味和揮發性的差異、顏色差異、溶解行為差異、旋光性差異、對光吸收差形色譜差異等。


(1)溶解行為的差異:如葡萄糖中檢查糊精,葡萄糖在乙醇中加熱溶解,糊精則不溶,規定應澄明。


(2)對光吸收的差異:利用藥物與雜質對Vis,,UV,IR,原子吸收光譜的不同,進行檢查。優點是靈敏度高,適用于微量物質的檢查。


(3)吸附或分配性質的差異(色譜差異)

TLC:根據藥物與雜質對吸附劑的吸附或展開劑的解析能力不同,加以分離和檢查。


HPLC法:利用HPLC法檢查藥物中的雜質。


2、利用藥物和雜質在化學性質上的差異


(1)酸堿性的差異:若有雜質,可用如下方法檢查:①規定消耗滴定液的體積;②pH值測定法;③指示劑法。


(2)氧化還原性質的差異:利用藥物與雜質氧化還原電位的差異進行檢查,如氯化物中碘化物或溴化物的檢查。


(3)雜質與一定的試劑反應產生沉淀:如生物堿中其他生物堿的檢查,多采用此法。


(4)雜質與一定的試劑反應產生顏色:利用藥物中的雜質與某些試劑發生氧化、絡合、偶合等顯色反應,進行藥物中雜質的鑒別。


(5)雜質與一定的試劑反應產生氣體:利用此法可檢查藥物中的砷、硫、碳酸鹽、氨鹽、氰化物等。例如氰化物的檢查中國藥典采用:①改進普魯士藍法;②氣體擴散-三硝基苯酚鋰法。


(6)藥物經有機破壞后檢查雜質:①硒的檢查;②氟的檢查。


三、安全性檢查法


1、熱原檢查法 

    

本法系將一定劑量的供試品,靜脈注入家兔體內,在規定時間內,觀察家兔體溫升高的情況,以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規定。

            

取適用的家兔3只,測定其正常體溫后15分鐘以內,自耳靜脈緩緩注入規定劑量并溫熱至約38℃的供試品溶液,然后每隔1小時按前法測量其體溫1次,共測3次,以3次體溫中最高的一次減去正常體溫,即為該兔體溫的升高度數。如3只家兔中有1只體溫升高0.6℃或0.6℃以上,或3只家兔體溫升高均低于0.6℃,但升高的總數達1.4℃或1.4℃以上,應另取5只家兔復試,檢查方法同上。


2、細菌內毒素檢查法

     

本法系用鱟試劑與細菌內毒素產生凝集反應的機理,以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法。內毒素的量用內毒素單位(EU)表示。   

     

取裝有0.1ml鱟試劑溶液的10×75mm試管(或0.1ml/支規格的鱟試劑原安瓿)4支,其中2支加入0.1ml供試品作為供試品管,1支加入2λ<[b]>內毒素工作標準品溶液0.1ml作為陽性對照管,1支加入細菌內毒素檢查用水①0.1ml作為陰性對照管。將試管中溶液輕輕混勻后,封閉管口,垂直放入37±1℃水浴中,保溫60±2分鐘。保溫和拿取試管過程應避免受到振動造成假陰性結果。


3、異常毒性及特異性毒性檢查法  

    

本法系將一定劑量的供試品溶液注入小鼠體內或口服給藥,在規定時間內觀察小鼠死亡情況,以判定供試品是否符合規定的一種方法。


4、降壓物質檢查法 

   

本法系比較組胺對照品(S)與供試品(T)引起麻醉貓血壓下降的程度,以判定供試品中所含降壓物質的限度是否符合規定。


5、過敏反應檢查法  

  

本法系將一定量的供試品溶液注入豚鼠體內,間隔一定時間后靜脈注射供試品溶液進行攻擊,觀察動物出現過敏反應的情況,以判定供試品是否引起動物全身過敏反應。


四、無菌檢查法


無菌檢查法系指檢查藥品、敷料、縫合線、無菌器具及適用于藥典要求無菌檢查的 其他品種是否無菌的一種方法。無菌檢查在潔凈度100級單向流空氣區域內進行,其全過程應嚴格遵守無菌操作,防 止微生物污染。單向流空氣區與工作臺面,必須進行潔凈度驗證。


五、微生物限度檢查法


微生物限度檢查法系檢查非規定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。


檢查項目包括細菌數、霉菌數、酵母菌數及控制菌檢查。


微生物限度檢查應在環境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區域內進行。檢查過程必須嚴格遵守無菌操作,防止再污染。單向流空氣區域、工作臺面及環境應定期按《醫藥工業潔凈室(區)懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準進行潔凈度驗證!


供試品檢查時,如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑,應證明其有效性及對微生物的生長和存活無影響。


以上就是生物藥物監測技術中常用到的幾個監測技術。檢測技術千千萬萬,只用一個技術當然檢測不好,但是多個檢測技術合起來一起用的時候就能發揮巨大的能量。

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