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【精華】菌落總數檢測技術要點!
發布時間:2020-10-20編輯:
食品中細菌數量可反映該食品被污染的程度,預測食品耐放程度和時間,估測出食品腐敗狀況,是食品衛生檢測的重要指標,應該如何檢測呢?


一、菌落總數的概念


1、菌落總數


食品檢樣經過處理,在一定條件下培養后(如培養基成分、培養溫度和時間、pH、需氧性質等),所得1mL(或1g)檢樣中形成菌落的總數。


按國家標準方法規定,即在需氧情況下,37℃培養48h,能在平板計數瓊脂平板上生長的細菌菌落總數,所以厭氧或微需氧菌、有特殊營養要求的以及非嗜中溫的細菌,由于現有條件不能滿足其生理需求,故難以繁殖生長。因此菌落總數并不表示實際中的所有細菌總數,菌落總數并不能區分其中細菌的種類,所以有時被稱為雜菌數,需氧菌數等。


2、細菌總數


細菌總數指一定數量或面積的食品樣品.經過適當的處理后,在顯微鏡下對細菌進行直接計數。其中包括各種活菌數和尚未消失的死菌數。細菌總數也稱細菌直接顯微鏡數。


通常以1g或1mL或1cm2樣品中的細菌總數來表示。



3、菌落總數在食品衛生質量評價中的意義


(1)食品中細菌數量可反映該食品被污染的程度 


新鮮的食品內部一般是沒有或很少有細菌的,但由于外界污染情況不同,食品被細菌污染的多少就有所不同。食品中細菌數量越多,說明被污染的程度就越嚴重,越不新鮮,對人體健康威脅越大。相反,食品中菌數越少,說明該食品被污染的程度越輕,食品衛生質量越好,對人體健康影響也越小。 


(2)食品中細菌數量可預測食品耐放程度和時間


一般講,細菌數越少,食品耐放時間越長;相反,食品耐放時間就越短,例如用0℃保存牛肉,菌落總數為103cfu/cm2時,可保存18天,而當菌落總數增至l05cfu/cm2時則只能保存7天。另外,用0℃保存魚時,菌落總數為105cfu/cm2時可保存6天。而菌落總數在103cfu/cm2時則可保存12天。


(3)食品中細菌數量可估測出食品腐敗狀況 


一般認為日常食品的活菌數為104~107cfu/g。而當活菌數達到108cfu/g則可認為處于初期腐敗階段。例如,活的家禽,皮膚表面的細菌數可低到1.5×103cfu/cm2。而加工后馬上檢測可達3.5×104cfu/cm2。當菌落數為107cfu/cm2時表示確已經腐敗,雞肉的細菌數達108cfu/cm2時可有氣味并變粘。


一般講,食品中細菌數量越多,則會加速腐敗變質過程的進程,甚至可能引起食用者的不良反應。


二、菌落總數檢測方法


菌落總數的常規檢驗方法菌落總數的常規檢驗方法(GB4789.2-2016)。


基本操作一般包括:樣品的稀釋——傾注平皿——培養48(24)小時——計數報告。



1、樣品的處理和稀釋


(1)操作方法


①以無菌操作取檢樣25g(或25ml),放于225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(瓶內預置適當數量的玻璃珠)或滅菌乳缽內,經充分振要或研磨制成1:10的均勻稀釋液。


固體檢樣在加入稀釋液后,最好置滅菌均質器中以8000~10000r/min的速度處理1min,制成1:10的均勻稀釋液。


②用1ml滅菌吸管吸取1:10稀釋液1ml,沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內,振搖試管混合均勻,制成1:100的稀釋液。


③另取1ml滅菌吸管,按上項操作順序,制10倍遞增稀釋液,如此每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管。


(2)無菌操作


操作中必須有“無菌操作”的概念,所用玻璃器皿必須是完全滅菌的。所用剪刀、鑷子等器具也必須進行消毒處理。樣品如果有包裝,應用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。


操作應當在超凈工作臺或經過消毒處理的無菌室進行。瓊脂平板在工作臺暴露15分鐘,每個平板不得超過15個菌落。


(3)采樣的代表性


如系固體樣品,取樣時不應集中一點,宜多采幾個部位。固體樣品必須經過均質或研磨,液體樣品須經過振搖,以獲得均勻稀釋液。


4、稀釋液


樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水,有的采用磷酸鹽緩沖液(或0.1%蛋白胨水),后者對食品已受損傷的細菌細胞有一定的保護作用。如對含鹽量較高的食品(如醬油)進行稀釋,可以采用滅菌蒸餾水。


2、傾注培養


1、操作方法


(1)根據標準要求或對污染情況的估計,選擇2~3個適宜稀釋度,分別在制10倍遞增稀釋的同時,以吸取該稀釋度的吸管移取1mL稀釋液于滅菌平皿中,每個稀釋度做兩個平皿。


(2)將涼至46℃平板計數瓊脂培養基注入平皿約15mL,并轉動平皿,混合均勻。同時將平板計數瓊脂培養基傾入加有1mL稀釋液(不含樣品)的滅菌平皿內作空白對照。


(3)待瓊脂凝固后,翻轉平板,置36±1℃溫箱內培養48±2h,取出計算平板內菌落數目,乘以稀釋倍數,即得每克(每毫升)樣品所含菌落總數。


(4)傾注用培養基應在46℃水浴內保溫,溫度過高會影響細菌生長,過低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻。如無水浴,應以皮膚感受較熱而不燙為宜。


傾注培養基的量規定不一,從12~20ml不等,一般以15ml較為適宜,平板過厚可影響觀察,太薄又易于干裂。傾注時,培基底部如有沉淀物,應將底部棄去,以免與菌落混淆而影響計數觀察


(5)為使菌落能在平板上均勻分布,檢液加入平皿后,應盡快傾注培養基并旋轉混勻,可正反兩個方向旋轉,檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min,以防止細菌有所死亡或繁殖。


(6)溫較低,故多采用30℃。培養時間一般為48h,有些方法只要求24h的培養即可計數。培養箱應保持一定的濕度,瓊脂平板培養48h后,培養基失重不應超過15%。


(7)為了避免食品中的微小顆;蚺嗷械碾s質與細菌菌落發生混淆,不易分辨,可同時作一稀釋液與瓊脂培養基混合的平板,不經培養,而于4℃環境中放置,以便計數時作對照觀察。


在某些場合,為了防止食品顆粒與菌落混淆不清,可在營養瓊脂中加入氯化三苯四氮唑(TTC),培養后菌落呈紅色,易于分別。


3、計數和報告


(1)操作方法


培養到時間后,計數每個平板上的菌落數。可用肉眼觀察,必要時用放大鏡檢查,以防遺漏。在記下各平板的菌落總數后,求出同稀釋度的各平板平均菌落數,計算出原始樣品中每克(或每ml)中的菌落數,進行報告。


(2)計數


到達規定培養時間,應立即計數。如果不能立即計數,應將平板放置于0-4℃,但不得超過24h。


(3)稀釋度選擇及菌落數報告方式


①若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內,計算兩個平板菌落數的平均值,再將平均值乘以相應稀釋倍數,作為每克(或毫升)中菌落總數結果。


②若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時,按式(l)計算:


N=∑C/(n1+0.1n2)d……………………(1)

式中:
N―樣品中菌落數;
∑C―平板(含適宜范圍菌落數的平板)菌落數之和;
n 1―第一個適宜稀釋度接種平板個數
n2―第二個適宜稀釋度接種平板個數;
d―稀釋因子(第一稀釋度)。


③若所有稀釋度的平板上菌落數均大于300,則對稀釋度最高的平板進行計數,其他平板可記錄為多不可計,結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算。


④若所有稀釋度的平板菌落數均小于30,則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。


⑤若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀釋倍數計算。


⑥若所有稀釋度的平板菌落數均不在30~300之間,其中一部分小于30或大于300時,則以最接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。


(4)菌落總數的報告


①菌落數在100以內時,按“四舍五人”原則修約,采用兩位有效數字報告。


②人”原則修約后,取前兩位數字,后面用0代替位數;也可用10的指數形式來表示,按“四舍五入”原則修約后,采用兩位有效數字。


③若所有平板上為蔓延菌落而無法計數,則報告菌落蔓延。


④若空白對照上有菌落生長,則此次檢測結果無效。


⑤稱重取樣以CFU/g為單位報告,體積取樣以CFU/mL 為單位報告。


4、特別注意


(1)不同稀釋度的菌落數應與稀釋倍數成反比(同一稀釋度的二個平板的菌落數應基本接近),即稀釋倍數愈高菌落數愈少,稀釋倍數愈低菌落數愈多。如出現逆反現象,則應視為檢驗中的差錯(有的食品有時可能出現逆反現象,如酸性飲料等),不應作為檢樣計數報告的依據。


(2)當平板上有鏈狀菌落生長時,如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限,則應作為一個菌落計,如存在有幾條不同來源的鏈,則每條鏈均應按一個菌落計算,不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數。如有片狀菌落生長,該平板一般不宜采用,如片狀菌落不到平板一半,而另一半又分布均勻,則可以半個平板的菌落數乘2代表全平板的菌落數。


(3)當計數平板內的菌落數過多(即所有稀釋度均大于300時),但分布很均勻,可取平板的一半或1/4計數。再乘以相應稀釋倍數作為該平板的菌落數。

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