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如何保證微生物檢測結果的準確性?要點在這!
發布時間:2020-09-22編輯:

食品微生物檢驗的質量控制其實就是為了滿足實驗室質量要求,制定的相應的計劃并實施的一系列的系統活動。其中質量控制可分為兩類:內部質量控制和外部質量評價。今天咱們就聊一聊如何保證微生物檢測結果的準確性?這幾個方面要做好!



內部質量控制 



是指實驗室內部采取的以比對分析、跟蹤以及對實驗室工作的連續性控制計劃。這是實驗室質量保證的核心和基礎,通過對檢驗人員、操作手冊、檢測環境、設備儀器及其功能檢測、培養基試劑染色液等質量控制、檢驗過程的質量控制、標準菌株、以及實驗室安全防護等方面的要求來進行的。這方面的內容包含微生物檢測實驗室日常運營的方方面面,一個健全完整的實驗室應當在這些方面滿足要求。


1、對于檢測人員,應當具備相應的技術能力,并可以提供具備相應技術能力的證明,比如相應的證書等。CNAS-CL09中明確要求:實驗室從事微生物檢測的關鍵檢測人員應至少具有微生物或相關專業?萍耙陨蠈W歷,或者具有10年以上微生物檢測工作經歷。這些都是對實驗室檢測人員的客觀和硬性的要求,另外實驗室檢驗人員還應具有高度的主觀判斷力,根據個人的技能、經驗以及細菌學的專業水平可以對實驗操作以及實驗結果進行判斷和分析。同時,實驗室還應當有相應技術能力的人負責實驗室內的技術工作,并設立質量監督員。


2、實驗室的操作手冊,是指實驗室應當有一套系統的文件要求,包含實驗室運營的各個方面,包括但不限于各級人員的職責和權限、實驗室安全措施、樣品采集和處理指南、培養基和試劑的配制方法等。實驗室的操作手冊是綱領性的文件,并且不是一成不變的,在實驗室發生改變或者有重大變動時,也應當相應的修改操作手冊以適應實驗室的運營。


3、對于檢測環境的要求,應當滿足國家標準,要求檢測室內足夠寬敞、通風并有良好的照明,檢測室內墻面地面采用易清潔的材料,可以根據工作內容將檢測室加以分用,設立專用房間。


總之實驗室的構造必須滿足GB 4789.1-2016中要求。另外,各區域也應當各自的環境要求,并需要做好相關的記錄,例如樣品存放區、檢測用無菌物品存放區應當監控溫濕度并做好記錄;無菌室應當按一定頻率監控微生物指標并記錄等,這些監控頻率也都應在實驗室操作手冊中作出明確的要求。對于各功能間也應布局合理,其中準備區域、培養區域、檢測無菌區域應盡量分開,各區域也應做好標識。


4、實驗室的儀器設備,應當能夠滿足開展相關檢測項目的要求,并制定相關設備儀器的作業指導書,關于一些特殊的設備儀器,例如蒸汽壓力滅菌器等,需要人員取得相應的設備操作證書方可進行操作。


儀器設備的存放環境也應滿足儀器本身使用要求,例如天平要放置在無振動無氣流影響的水平臺面;顯微鏡的放置環境要求無振動、避免灰塵、防潮等。


另外,儀器設備也應定期進行鑒定校準并記錄其運行狀況,維修后的儀器設備應當進行再校準,經檢定后才可重新投入使用,并且整個維修和檢定過程都應形成詳細完整的報告。


下表是部分儀器設備檢定和核查要求:



以上的校準、檢定和核查,都需要詳細的進行記錄,并給出明確的檢定結果鑒定。


5、常用培養基和試劑質量控制。首先要從培養基的物理、化學及生物學指標進行鑒定。例如培養基的感官,顏色級透明度;培養基的pH,以及無菌試驗、生長率實驗等。


商品化培養基存放環境也應滿足培養基要求。培養基的配制過程必須統一標準,添加劑的劑量、pH以及滅菌時間或溫度都須遵照規定,培養基名稱、每批配制量、配方、配制日期和配制人員姓名都必須詳細記錄。另外配置培養基過程中使用到的儀器設備必須是經過檢定的。


配制好的培養基保存環境應為0-4℃,如制成平板組需要用塑料袋包裝好至于0-4℃環境保存,但若是含有高濃度膽鹽的培養基應當存放在10-15℃的環境中,值得注意的是,配制好的培養基(尤其是糖發酵管)不宜久放,防止培養基會吸收空氣中的二氧化碳導致培養基變酸影響細菌生長。


6、試劑的管理要求與培養基基本相同,下表是部分常用試劑進行陰性陽性檢定時用的菌株。



7、實驗室檢驗過程的質量控制,也可以通過檢測質量保證、菌落計數的精密度控制、菌種鑒定質控等幾個方面來進行保證。


8、檢測質量的保證是實驗室最基礎的能力,即保證樣品檢驗過程的準確性,實驗室應定期使用標準物質進行實驗室內部的質量控制,也可參加實驗室間的比對或能力驗證。


另外,使用相同或者不同的試驗方法對相同樣品進行重復檢驗來驗證實驗室的檢驗過程也是常用的方法。對于計數的精密度也應做出明確的要求,以下是推薦的幾種情況下計數的準確度判斷:


同一平皿重復計數誤差應小于7.7%;實驗人員之間用同一平皿重復計數誤差±18.2%;自身同一梯度平行加樣兩皿間相對誤差小于7.7%,實驗人員之間用同一梯度計數誤差±18.2%,不同梯度這間菌落計數最終誤差小于7.7%。這是推薦使用的重復計數的要求,實驗室也可以根據實驗室情況來確定實驗室內部的誤差允許范圍,但誤差范圍也不應定的過大。關于計數精密度控制也建議每月進行1次。


9、實驗室應當制定標準菌株的保存及使用規范,這個規范也可以包含于實驗室操作手冊中。其中標準菌株要求是形態、染色反應、生理生化及血清學特性典型而穩定的菌株,要求實驗結果重復性好,不易發生變異的,通常來源于專門的機構,例如ATCC、CMCC、CICC等。


常用的菌種保藏方法包括冷凍干燥法(菌種保存中心常用)、冷凍保藏法、培養基保藏法等,各種保藏方法各有其優劣點,實驗室可根據實驗室內的條件選擇相應的保存方法。近年來興起的冷凍瓷珠保存法因為操作簡單、并且保存時間長等優點,已經逐漸成為實驗室主流的保藏菌種的方法。


10、最后,實驗室的安全防護也不應忽視。首先實驗室的管理人員以及實驗人員必須了解相關工作有關的危險,對于新員工以及檢測方法出現改變或啟用新設備時尤其需要注意。檢測過程中產生的廢棄物要經過處理才可廢棄,例如致病菌檢測過程中使用的培養基、鑒定試劑等要經過滅菌后方可廢棄。同時,進行致病性微生物相關工作的房間入口處必須要有生物危害的警示標志。


總之,實驗室的生物安全管理應當符合GB 19489-2008里的要求。


以上內容基本涵蓋了食品微生物檢驗實驗室的 內部質量控制,除了這些,還應定期開展實驗室間的質量評價。實驗室內部質量控制是質量保證體系的重要組成部分,實驗室應參加外部的質量控制活動,并且對于實驗室內開展的每一項檢測均應參加相應的實驗室間質量控制。




實驗室外部質量控制 



具體包括外部機構對實驗室進行的一系列的審核以及實驗室的檢測能力驗證。前者的檢查項目包括人員的資質以及相關培訓,儀器設備的使用、保養和維修校準記錄,培養基和試劑的配制記錄、保存方法、滅菌質量,操作手冊的執行、檢測方法和操作規范性,實驗室相關環境等等。


后者目前國內外廣泛采用的方法是用模擬食品標本做質量評價,主要評價實驗室在病原菌的分離、鑒定試驗等方面的工作情況。由質控管理機構發放模擬標本或菌種,實驗室按照日常的操作方法進行相應的分離鑒定試驗。實驗室完成鑒定后在規定時間內將檢測結果反饋至參考實驗室,質控管理部門會對質控結果進行統計分析,將實驗室的結果與標準進行比較和統計分析,并作出評估,反饋評估報告,確定實驗室相關的檢驗能力。實驗室也要根據評估報告對實驗室內部存在的相關問題進行整改,以符合相關的要求。


在微生物檢驗操作過程中,要保證檢測環境(如超凈臺、檢測室)以及所用工器具的潔凈程度,同時保證人員各種操作的規范性,盡量保證其無菌性,防止因人為原因操作失誤而出現誤差結果,同時在適宜溫度進行培養,為合理決策和指導生產提供依據。


為保證檢測結果的準確性,我們應做好以下幾個方面。


1、培養基的滅菌及使用


①每次配制時,要注意其生產日期是否在保質期內,查看其開瓶日期及瓶口密封性,保證其未變質,并且未吸潮。

②培養基配制時,稱量要準確,包括鹽水的分裝要準確。

③一定要保證現配制現滅菌,未滅菌的配好培養基不能長時間放置,更不可隔夜。 

④滅菌時要保證恒溫、恒壓,同時要保證有效的滅菌時間。 

⑤滅菌過的培養基要冰箱保存,可保存一周,一般不超過 3 天。而且要遵循“先入先出”原則,先配制的要先使用。

⑥在使用時,要根據當班次的使用量,用水浴鍋先將培養基溶化為液態,然后及時調低水浴溫度(先化好的可從水浴取出,放在水浴鍋鍋蓋上)待用,千萬不可長時間使培養基處于高溫狀態。

⑦做產品微生物檢測時,傾倒培養基溫度在 45℃左右,不可過燙,避免將菌燙死;也不可過涼,化好的培養基又結塊凝固,不便于觀察結果。

⑧每瓶培養基均要做空白。

⑨盡量集中做樣,避免頻繁打開同一瓶培養基瓶塞,增大培養基的污染幾率,出現誤差結果。

⑩培養基剩余過少時,可先將其傾倒成空白用板。


2、檢測環境的維持


大環境(檢測室):


(1)檢測時,窗戶和空調要關閉,或用酒精對房間進行噴霧消毒,避免房間內空氣流通影響超凈臺內部環境(最好在有通排風系統的恒溫恒濕無菌間進行操作)。

(2)如果在原來的原料微生物檢測室進行檢測,要定期開啟紫外燈,對房間進行殺菌。


小環境(超凈工作臺):


①定期清潔初效過濾器,要及時更換。

②檢測前,將超凈臺內部進行清潔,用 75%酒精進行擦拭消毒,并提前半小時將超凈臺紫外燈打開,對超凈臺內部環境進行殺菌。

③關紫外燈,開風機,調整合適進風量,風量不可過低。 

④每次檢測后,要對超凈臺內部進行清理、清潔,并用 75%酒精進行擦拭消毒。

⑤紫外燈根據其使用壽命要及時更換。 

⑥檢測同時,要做上相應菌落檢測的環境空白。

⑦檢測區域的選擇:

a.一般在距離超凈臺外沿的 1/3-2/3 區域進行無菌操作;

b.要在酒精燈火焰的外焰保護區域進行操作。


3、工器具的潔凈度


①玻璃器皿:采用干熱滅菌方式進行滅菌。 

②檢測用剪刀、勺子等物品要做到檢測專用,不可與其它操作器具混用,使用時,先用75%酒精消毒,再采用灼燒方式進行滅菌。 

③接種針(環)采用灼燒方式進行滅菌,但要注意檢測時要先將接種針(環)進行冷卻。


4、樣品的采集及檢測


①保證采樣器具的無菌性


(1)玻璃器皿:采用干熱滅菌方式進行滅菌,保證恒溫、時間足夠(但不可時間過長,容易導致玻璃器皿易裂紋而報廢)。 

(2)取樣筐:使用前要用75%酒精進行噴灑消毒。 

(3)取樣勺:要保證其清潔消毒,清潔后用75%酒精進行擦拭消毒。 

(4)取樣袋:可先用酒精進行擦拭消毒,再在超凈臺用紫外燈照射消毒,(包裝車間要在傳遞窗用紫外燈照射消毒)。 

(5)電子稱表面用 75%酒精消毒。


②人員操作


(1)保證手部的清洗、消毒:取樣前及檢測前都要先洗手再消毒。

(2)取樣要具有代表性(隨機樣、目的樣、綜合樣)且要標示清楚。

(3)取樣完畢,不可在車間逗留,要及時將樣品放入超凈臺,對其外表面進行紫外燈照射消毒。

(4)在要求的檢測區域進行操作。

(5)檢測前,要用 75%酒精棉球對樣品袋口部進行擦拭消毒,再開口。

(6)往鹽水瓶加樣品時,要注意勺子或袋子盡量不接觸瓶口。

(7)樣品計量要準確,稀釋倍數也要準確(1mL 吸管不允許將管口敲掉),進行 100 倍稀釋時,1mL 吸管要伸入鹽水中,不可以將樣品從管壁流下去,同時要避免將管底部捅破。

(8)鹽水溫度以 40℃左右為宜,不能過熱,會將部分微生物燙死;也不能溫度太低,不能將樣品溶解完全。

(9)進行稀釋時,要搖勻,保證溶液的均一性。

(10)傾倒平皿時,要注意培養基瓶口不要接觸到平皿;傾倒的培養基要適量,不可以太少,在培養過程中易干掉,微生物亦死亡,以 15mL 左右為宜。

(11)做大腸菌群樣時,要提前將乳糖膽鹽培養基培養管按需要量備好,放入超凈臺對外表面進行紫外線滅菌。

(12)接二步時,要注意先將接種針(環)進行冷卻,避免出現接不上菌落的情況,導致無法判斷、確認。

(13)檢測完畢,及時放入相應培養箱進行培養,并清理清潔超凈臺。


5、微生物的培養


①在培養過程中,要隨時監控培養箱溫度,保證其在適宜的溫度進行培養。

②要按照《微生物檢驗規范》要求及時觀察結果,出現異常,要及時分析原因進行反饋。

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