當前所在頁面：一、菌落總數測定經驗分享
菌落(colony)是指細菌在固體培養基上發育而形成的能被肉眼所識別的生長物，它是由數以萬計的相同細菌聚集而成的，故又有細菌集落之稱。
菌落總數是指在被檢樣品的單位重量(g)、容積(mL)或表面積內，所含能于某種固體培養基上，在一定條件下培養后所生成的細菌集落的總數。
菌落總數主要是作為判定食品被細菌污染程度的標記，也可以應用這一方法觀察食中細菌的性質以及細菌在食品中繁殖的動態，以便對被檢樣品進行衛生學評價時提供科學依據。
（1）菌落總數的測定。是以檢樣中的細菌細胞和營養瓊脂混合后，每個細菌細胞都能形成一個可見的單獨菌落的假定為基礎的。由于檢驗中采用36℃于有氧條件下培養(空氣中含氧約20％)，因而并不能測出每g或mL檢樣中實際的總活菌數，厭氧菌、微嗜氧菌和嗜冷菌在此條件下不生長，有特殊營養要求的一些細菌也受到了限制，因此所得結果，只包括一群能在普通營養瓊脂中發育、嗜中溫的、需氧和兼性厭氧的細菌菌落的總數。
（2）鑒于食品檢樣中的細菌細胞是以單個，成雙、鏈狀、葡萄狀成堆的形式存在，因而在營養瓊脂平板上出現的菌落可以來源于細胞塊，也可以來源于單個細胞，因此平板上所得需氧和兼性厭氧菌菌落的數字不應報告活菌數，而應以單位重量、容量或表面積內的菌落數或菌落形成單位數(colony forming units，CFU)報告之。
（3）每種細菌都有它一定的生理特性，培養時，應用不同的營養條件及其他生理條件(如溫度、培養時間、pH、需氧性質等)去滿足其要求，才能分別將各種細菌都培養出來。因此，要得到較全面的細菌菌落總數，應將檢樣接種到幾種不同的非選擇性培養基上，并培養在不同條件下，如溫度，氧氣供應等。但國家頒發的食品衛生標準對不同食品的菌落總數的規定，都是根據用普通營養瓊脂進行需氧培養所得的結果確定的，因此在食品的一般衛生學評價中并不要用幾種不同的非選擇性培養基培養。
測定食品中菌落總數時，是將食品檢樣做成幾個不同的10倍遞增稀釋液，然后從各個稀釋液中分別取出一定量在平皿內與營養瓊脂相混合，經培養后，按一定要求計算出皿內瓊脂平板上所生成的細菌集落數，并再根據檢樣的稀釋倍數，計算出每g或mL樣品中所含細菌菌落的總數。
為了正確地反映食品中各種需氧和兼性厭氧菌存在的情況，檢驗時必須遵循以下一些要求和規定。
（1）所用器皿及稀釋液
①檢驗中所用玻璃器皿，如培養皿，吸管、試管等必須是完全滅菌的，并在滅菌前徹底洗滌干凈，不得殘留有抑菌物質。
②用作樣品稀釋的液體，每批都要有空白對照。如果在瓊脂對照平板上出現幾個菌落時，要追加對照平板，以判定是空白稀釋液，用于傾注平皿的培養基，還是平皿吸管或空氣可能存在的污染。
③檢樣的稀釋液雖可用滅菌鹽水或蒸餾水，但以用磷酸緩沖鹽水特別是0.1％蛋白胨水為合適，因蛋白胨水對細菌細胞有更好的保護作用，不會因為在稀釋過程中而使食品檢樣中原已受損傷的細菌細胞導致死亡。如果對含鹽量較高的食品(如醬品等)進行稀釋，則宜采用蒸餾水。
（2）檢樣稀釋
①檢樣稀釋時，應以無菌稱取(或量取)有代表性的液體樣品25g(或mL)剪碎放于含有225mL滅菌稀釋液的玻璃瓶內(瓶內預置適當數量的玻璃珠)，經充分振搖作成1:10的稀釋液。
如系肉、魚等固體樣品，最好剪細于無菌均質袋與稀釋液拍擊均勻，或與稀釋液同置于滅菌均質器杯中，以8000~l 0000rpm速度攪拌1分鐘，使做成均勻的1:10稀釋液。
②根據食品衛生標準要求或對標本污染情況的估計，將上述1:10的檢樣稀釋液再做成幾個適當的10倍遞增稀釋液。即取1:10稀釋液1mL與9mL稀釋液混和做成1:100的稀釋液，然后依次遞增稀釋，做成1:1000、1:10000等稀釋液。注意每遞增稀釋一次，必須另換1支1mL滅菌吸管，這樣所得檢樣的稀釋倍數方為準確。
③從吸管筒內取出滅菌吸管時，不要將吸管尖端碰著其他仍留在容器內的吸管的外露部分；而且吸管在進出裝有稀釋液的玻璃瓶和試管時，也不要觸及瓶口及試管口的外側部分；因為這些部分都可能接觸過手或其他沾污物。
④在作10倍遞增稀釋中，吸管插入檢樣稀釋液內不能低于液面2.5cm；吸入液體時，應先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端離開液面，將尖端貼于玻璃瓶或試管的內壁使吸。管內液體調至所要求的刻度，這樣取樣較準確，而且在吸管從稀釋液內取出時不會有多余的液體粘附于管外。
⑤當用吸管將檢樣稀釋液加至另一裝有9mL空白稀釋液的試管內時，應小心沿管壁加入，不要觸及管內稀釋液，以防吸管尖端外側部分粘附的檢液也混入其中。
（3）平板接種與培養
①將稀釋液加至滅菌平皿內時，應根據食品衛生標準要求或對標本污染情況的估計，選擇2~3個適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移lmL稀釋液加入皿內(從皿側加入，不要揭去皿蓋)，最后將吸管直立使液體流畢，并在皿底干燥處再擦一下吸管尖將余液排出，而不要吹出。每個稀釋度應作2個平皿。
②用于傾注平皿的營養瓊脂應預先加熱使其融化,并保溫于(45±1)℃恒溫水浴中待用。溫度太高影響細菌生長,太低瓊脂易凝固不能與檢液充分混勻, 傾注平皿時,每皿內傾入約15mL,平板過厚可影響觀察,太薄又易干裂,最后將瓊脂底部帶有沉淀的部分棄去。
※為了防止細菌增殖及產生片狀菌落,在檢液加入平皿后,應盡快傾注培養基并旋轉混勻,可正反兩個方向旋轉,以使充分混勻。旋轉中應加小心，不要使混和物濺到皿邊的上方。檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min。瓊脂凝固后,在數分鐘內即應將平皿翻轉予以培養,這樣可避免菌落蔓延生長。
③為了控制污染,需做空白對照實驗,在取樣進行檢驗的同時,于工作臺上打開一塊瓊脂平板,其暴露的時間,應與該檢樣從制備、稀釋到加入平皿時所暴露的最長的時間相當,然后與加有檢樣的平皿一并置于溫箱內培養,以了解檢樣在檢驗操作過程中有無受到來自空氣的污染。
④皿內瓊脂凝固后，不要長久放置，然后始翻轉培養；易于瓊脂凝固后，在數分鐘內即應將平皿翻轉予以培養，這樣可避免菌落蔓延生長。必要時，可先將皿打開倒置(皿底向上)于溫箱內經15~60分鐘使瓊脂表面干燥后，再將皿底移至蓋內倒置于溫箱內培養。這樣可以阻止運動性強的變形桿菌屬、假單胞菌屬和芽胞桿菌屬中一些菌株在瓊脂表面擴展生長。
⑤為了控制污染，在取樣進行檢驗的同時，于工作臺上打開一塊瓊脂平板，其暴露的時間，應與該檢樣從制備、稀釋到加入平皿時所暴露的最長的時間相當，然后與加有檢樣的平皿一并置于溫箱內培養，以了解檢樣在檢驗操作過程中有無受到來自空氣的污染。
⑥培養溫度，應根據食品種類而定。肉、，乳、蛋類食品用36℃培養，培養時間為48±2小時。水產品用30℃培養,培養時間為72±2小時。培養溫度和時間之所以有這種不同的區分，乃是因為在制定這些食品衛生標準中關于菌落總數的規定時，分別采用了不同的溫度和培養時間所取得的數據之故。水產品因來自淡水或海水，水底溫度較低，因而制定水產品細菌方面的衛生標準時，系用30℃作為培養的溫度。
（1）加入平皿內的檢樣稀釋液(特別是10-1的稀釋液)，有時帶有食品顆粒，在這種情況下，為了避免與細菌菌落發生混淆，可作一檢樣稀釋液與瓊脂混和的平皿，不經培養，而于4℃環境中放置，以便在計數撿樣菌落時用作對照。
（2）為了防止檢樣中食品顆粒與菌落混淆，也可在已溶化而保溫于45℃水浴內的瓊脂中，按每100mL加lmL0.5％氯化三苯四氮唑(2，3，5triphenyltetrazolium chloride，TTC)水溶液之量加入適量的TTC。培養后，如系食品顆粒，不見變化。如為細菌，則生成紅色菌落。配好的TTC溶液，應先用來與不加TTC的作對照，以觀察其對計數是否有不利的作用(TTC在一定濃度下對革蘭氏陽性菌有抑制作用)。TTC溶液要放冷暗處保存，以防受熱與光照而發生分解。無色的TTC是作為受氫體加入培養基中，如果有細菌存在，培養后，在細菌脫氫酶的作用下，TTC便接受氫而成為紅色的三苯基甲艏(formazan)，使菌落呈現紅色。
（1）從溫箱內取出平皿進行菌落計數時，應先分別觀察同一稀釋度的兩個平皿和不同稀釋度的幾個平皿內平板上菌落生長情況。平行試驗的2個平板與菌落數應該接近，不同稀釋度的幾個平板上菌落數則應與檢樣稀釋倍數成反比，即檢樣稀釋倍數越大，菌落數越低，稀釋倍數越小，菌落數越高。
（2）計數菌落時，應選取菌落數在30~300之間的平板作為菌落總數測定的標準。一個稀釋度使用兩個平板，應采用兩個平板平均數；如其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數，若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數。如在一個稀釋度的兩個平板中，一個平板的菌落數在30一300之間，另一個大于300或小于30時，則以菌落數在30—300間的平板作為計數的標準。
（3）菌落計數所得結果，可分別按以下幾種不同情況作報告：
a、若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內,計算兩個平板菌落數的平均值,再將平均值乘以相應稀釋倍數,作為每g(mL)樣品中菌落總數結果。
b、若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時,按式(1)計算:
示例:
c、若所有稀釋度的平板上菌落數均大于300CFU ,則對稀釋度最高的平板進行計數,其他平板可記錄為多不可計,結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算。
d、若所有稀釋度的平板菌落數均小于30CFU ,則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。
e、若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀釋倍數計算。
d、若所有稀釋度的平板菌落數均不在30CFU~300CFU之間,其中一部分小于30CFU或大于300CFU時,則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。
（4）注意事項
①如果稀釋度大的平板上菌落數反比稀釋度小的平板上菌落數高，則系檢驗工作中發生的差錯，屬實驗室事故。此外，也可能因抑菌劑混入樣品中所致，均不可用作檢樣計數報告的依據。
②如果平板上出現鏈狀菌落，菌落之間沒有明顯的界限，這是在瓊脂與檢樣混合時，一個細菌塊被分散所造成。一條鏈作為一個菌落計，如有來源不同的幾條鏈，每條鏈作為一個菌落計，不要把鏈上生長的各個菌落分開來數。
③如果所有平板上都有菌落密布，不要用多不可計作報告，而應在稀釋度最大的平板上，任意數其中2cm2個，除2求出每cm2內平均菌落數乘以皿底面積63.6cm2數，再乘其稀釋倍數作報告。如所用平皿的皿底直徑不是9cm，則可按其直徑的實際cm數代人圓面積公式求出。
④檢樣如系微生物類制劑(如酸牛乳、酵母制酸性飲料)，則平板計數中應相應地將有關微生物(乳酸桿菌、酵母菌)排除，不可并入檢樣的菌落總數內作報告。一般在校正檢樣的pH7.6后，再進行稀釋和培養，此類嗜酸性微生物往往即不易生長。并可用革蘭氏法染色鑒別。染色鑒別時，要用不校正pH的檢樣做成相同稀釋度的稀釋液培養所生成的菌落涂片染色作對照，以資辨別。酵母菌卵圓形，遠比細菌大，大小為2～5×5～30μm，革蘭氏陽性著色。乳酸桿菌在24小時內，于普通營養瓊脂平板上在有氧條件下培養，通常是不生長的。
（1）菌落數小于100CFU時,按“四舍五入”原則修約,以實有數報告。
（2）菌落數大于或等于100CFU時,第3位數字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數字,后面用0代替位數;也可用10的指數形式來表示,按“四舍五入”原則修約后,采用兩位有效數字。
（3）若所有平板上為蔓延菌落而無法計數,則報告菌落蔓延。
（4）若空白對照上有菌落生長,則此次檢測結果無效。
（5）稱重取樣以CFU/g為單位報告,體積取樣以CFU/mL為單位報告。
a、檢樣為固體，用重量法取樣檢驗時，以g為單位報告其菌落數；檢樣為液體，用容量法取樣檢驗時，以mL為單位報告其菌落數；如檢樣為樣品表面的涂擦液，則應以cm2為單位報告其菌落數。
b、如檢樣為液體，在兩個平皿內所加lmL未經稀釋的檢樣(原液)培養中，均無細菌集落生成，則報告為lmL檢樣內未有菌落生長，或1mL檢樣內菌落數<1。
二、微生物檢測常用的滅菌和消毒方法
消毒和滅菌兩個詞在實際使用中常被混用，其實它們的含義是有所不同的。消毒是指應用消毒劑等方法殺滅物體表面和內部的病原菌營養體的方法，而滅菌是指用物理和化學方法殺死物體表面和內部的所有微生物，使之呈無菌狀態。
（1）溫度
利用溫度進行滅菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高溫可使微生物細胞內的蛋白質和酶類發生變性而失活，從而起滅菌作用，低溫通常起抑菌作用。
①干熱滅菌法：
a.灼燒滅菌法：利用火焰直接把微生物燒死。此法徹底可靠，滅菌迅速，但易焚毀物品，所以使用范圍有限，只適合于接種針、環、試管口及不能用的污染物品或實驗動物的尸體等的滅菌。
b.干熱空氣滅菌法：這是實驗室中常用的一種方法，即把待滅菌的物品均勻地放入烘箱中，升溫至160℃，恒溫1小時即可。此法適用于玻璃皿、金屬用具等的滅菌。
②濕熱滅菌法：
在同樣的溫度下，濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好，這是因為一方面細胞內蛋白質含水量高，容易變性。另一方面高溫水蒸汽對蛋白質有高度的穿透力，從而加速蛋白質變性而迅速死亡。
a.巴氏消毒法：有些食物會因高溫破壞營養成分或影響質量，如牛奶、醬油、啤酒等，所以只能用較低的溫度來殺死其中的病原微生物，這樣既保持食物的營養和風味，又進行了消毒，保證了食品衛生。該法一般在62℃，30分鐘即可達到消毒目的。此法為法國微生物學家巴斯德首創，故名為巴氏消毒法。
b.煮沸消毒法：直接將要消毒的物品放入清水中，煮沸15分鐘，即可殺死細菌的全部營養和部分芽孢。若在清水中加入1%碳酸鈉或2%的石炭酸，則效果更好。此法適用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。
c.間歇滅菌法：上述兩種方法在常壓下，只能起到消毒作用，而很難做到完全無菌。若采用間歇滅菌的方法，就能殺滅物品中所有的微生物。具體做法是：將待滅菌的物品加熱至100℃，15~30分鐘，殺死其中的營養體。然后冷卻，放入37℃恒溫箱中過夜，讓殘留的芽孢萌發成營養體。第2天再重復上述步驟，三次左右，就可達到滅菌的目的。此法不需加壓滅菌鍋，適于推廣，但操作麻煩，所需時間長。
d. 加壓蒸汽滅菌法：這是發酵工業、醫療保健、食品檢測和微生物學實驗室中最常用的一種滅菌方法。它適用于各種耐熱、體積大的培養基的滅菌，也適用于玻璃器皿、工作服等物品的滅菌。
加壓蒸汽滅菌是把待滅菌的物品放在一個可密閉的加壓蒸汽滅菌鍋中進行的，以大量蒸汽使其中壓力升高。由于蒸汽壓的上升，水的沸點也隨之提高。在蒸汽壓達到1.055公斤/厘米2時，加壓蒸汽滅菌鍋內的溫度可達到121℃。在這種情況下，微生物（包括芽孢）在15~20分鐘便會被殺死，而達到滅菌目的。如滅菌的對象是砂土、石蠟油等面積大、含菌多、傳熱差的物品，則應適當延長滅菌時間。
在加壓蒸汽滅菌中，要引起注意的一個問題是，在恒壓之前，一定要排盡滅菌鍋中的冷空氣，否則表上的蒸汽壓與蒸汽溫度之間不具對應關系，這樣會大大降低滅菌效果。
③影響滅菌的因素：
a.不同的微生物或同種微生物的不同菌齡對高溫的敏感性不同。多數微生物的營養體和病毒在50~65℃，10分鐘就會被殺死；但各種孢子、特別是芽孢最能抗熱，其中抗熱性最強的是嗜熱脂肪芽孢桿菌，要在121℃，12分鐘才被殺死。對同種微生物來講，幼齡菌比老齡菌對熱更敏感。
b.微生物的數量多少顯然會影響滅菌的效果，數量越多，熱死時間越長。
c.培養基的成分與組成也會影響滅菌效果。一般地講，蛋白質、糖或脂肪存在，則提高抗熱性，pH在7附近，抗熱性最強，偏向兩極，則抗熱能力下降，而不同的鹽類可能對滅菌產生不同的影響；固體培養基要比液體培養基滅菌時間長。
④滅菌對培養基成分的影響：
a.pH值普遍下降。
b.產生混濁或沉淀，這主要是由于一些離子發生化學反應而產生混濁或沉淀。例如Ca+2與PO4-3化合，就會產生磷酸鈣沉淀。
c.不少培養基顏色加深。
d.體積和濃度有所變化。
e.營養成分有時受到破壞。
（2）輻射
利用輻射進行滅菌消毒，可以避免高溫滅菌或化學藥劑消毒的缺點，所以應用越來越廣，目前主要應用在以下幾個方面：
１）接種室、手術室、食品、藥物包裝室常應用紫外線殺菌。
２）應用β射線作食品表面殺菌，γ射線用于食品內部殺菌。經輻射后的食品，因大量微生物被殺滅，再用冷凍保藏，可使保存期延長。
（3）過濾
采用機械方法，設計一種濾孔比細菌還小的篩子，做成各種過濾器。通過過濾，只讓液體培養基從篩子中流下，而把各種微生物菌體留在篩子上面，從而達到除菌的目的。這種滅菌方法適用于一些對熱不穩定的體積小的液體培養基的滅菌以及氣體的滅菌。它的最大優點是不破壞培養基中各種物質的化學成分。但是比細菌還小的病毒仍然能留在液體培養基內，有時會給實驗帶來一定的麻煩。
一般化學藥劑無法殺死所有的微生物，而只能殺死其中的病原微生物，所以是起消毒劑的作用，而不是滅菌劑。
能迅速殺滅病原微生物的藥物，稱為消毒劑。能抑制或阻止微生物生長繁殖的藥物，稱為防腐劑。但是一種化學藥物是殺菌還是抑菌，常不易嚴格區分。消毒劑在低濃度時也能殺菌（如1：1000硫柳汞）。由于消毒防腐劑沒有選擇性，因此對一切活細胞都有毒性，不僅能殺死或抑制病原微生物，而且對人體組織細胞也有損傷作用，所以只能用于體表、器械、排泄物和周圍環境的消毒。
常用的化學消毒劑有：石碳酸、來蘇水（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。
